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白菜抗TuMV基因工程

作者：佚名本日浏览：本周浏览：本月浏览：总浏览：总得票：投票：投它一票

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一、成果名称：白菜抗TuMV基因工程
    二、项目起止时间：1994年7月～1997年6月
    三、科研投资：25万元
    四、主要研究单位及主要人员
    主要研究单位：北京市农林科学院蔬菜研究中心
    主要研究人员：曹鸣庆、刘凡、姚磊
    五、主要研究内容
    本研究主要内容如下：
（一）NIa基因的分离和重组质粒构建
    1）以马铃薯Y病毒组的芜青花叶病毒（TuMV）为主要研究对象，采用分子克隆技术，分离、人工合成并扩增核内蛋白酶a（NIa）基因。
    2）在获得TuMV的NIa基因后，将其分步重组于嗜菌粒pBleuscript SK+、质粒pRTK6或pRT103、双元质粒pDHB321，最终获得两种重组双元质粒：含标记基因bar的pDHB321-pRT103-NIa；含双标记基因：抗卡那霉素的NPTⅡ基因和bar基因的pDHB321-pRTK6-NIa。经电激转化处理，将两种载体转化到农杆菌菌株C58/pMP90。
    （二）原位渗入转基因技术的研究和完善真空渗入原位（in situ infiltration）转基因技术借用于拟南芥。由于白菜株型较拟南芥大许多，加上受粉习性完全不同（拟南芥为自花受粉，而白菜为常异花受粉），不能完全采用拟南芥上建立的规范技术。经过反复实验，在以下方面取得重要进展：
    1）设计、研制了新型真空转化器。1995年设计了适用于白菜的第二代真空转化器，委托玻璃仪器厂试制一台。使用结果，该台仪器的转化效率较原有设备提高了近3倍（从1/10000提高到1/3500）。根据使用后暴露出来的缺点，1997年设计了第三代真空转化器，材料改为有机玻璃，重量减轻，成本降低，使用更加方便。
    2）明确了适用于白菜的真空渗入转化处理技术指标。它包括处理时植株的适宜发育期（以初花期为宜），处理时负压压力指标（10000Pa），处理时间（25分钟）以及处理株移栽后的管理方法，人工辅助授粉、种子收获等技术环节。
   （三）转基因植株的筛选
    在用农杆菌转化白菜的实验中，选用前述含单标记基因bar的双元质粒：pDHB321-pRT103-NIa。将从转化处理株上收获的种子萌发，用1％除草剂Basta喷施幼苗，筛选抗性株。分别在1995年、1996年筛选出33个抗Basta白菜株系。其中1995年获得8个株系，1996年25个株系。
    1）转基因株及其后代株系的鉴定：Southern和Northern杂交
提取抗Basta株叶片DNA和RNA，分别以bar和NIa为探针，作Southern杂交和Northern杂交。Southern杂交结果表明，bar基因和NIa基因均已插入核基因组。Northern杂交表明，在叶片中检测到bar基因和NIa基因转录的mRNA，证明这两个基因具有正常转录活性。
    2）转基因植株的遗传稳定性和纯合外源基因株的选择
经过连续5代的遗传测验，表明外源基因已牢固整合于小白菜“49菜心”核基因组，在遗传上十分稳定。
    bar基因表达Basta抗性，是显性表现型。以Basta筛选得到的抗性T0代株作自交和测交试验，后代鉴定结果表明，抗性株在遗传上全都表现为杂合的bar/-（可视为杂缺失）。通过对T2代的遗传分析，鉴定出117个纯合bar/bar株系，这些纯合株系的T3、T4及T5代群体仍保持对Basta的强抗性。砺凵险庑┲晗档哪康幕颉癗Ia”也应是纯合的。
   （四）抗TuMV转基因株系鉴定和高抗材料的获得
    从1996年春季以来，对筛选所得纯合转基因株系进行TuMV接种和抗病性鉴定。鉴定结果表明转基因株系对TuMV的抗性表现不一。从中筛选出高抗株系4个：T2-16、T2-19、T2-14和T2-20。
    六、与国内外同类研究比较
    与国内、外同类研究工作相比，本项研究取得的成果在下述三方面领先的：1、分离、克隆了抗TuMV的蛋白酶基因NIa，并构建了高效表达双元质粒pDHBNIa等，具有自主基因知识产权；2、不需离体培养的原位真空渗入转化技术，迄今仅用于模式植物拟南芥。本研究改进和发展了原位转化技术，得到表达稳定的转基因白菜，是国内外成功应用该技术的第一种农作物，具开创性；3、鉴定、筛选出高抗TuMV的转NIa基因4个白菜株系，是首次用转基因技术获得的TuMV新抗源。
    七、社会经济效益
    芜青花叶病毒是危害十字花科蔬菜（白菜、甘蓝、花椰菜、芥菜、萝卜等）最重要的病毒病原。自“六五”以来，白菜等蔬菜的抗芜青花叶病毒病育种一直是国家重点攻关研究课题。就大白菜而言，我国因该病毒病危害，平均每年造成5％的产量损失，有些年份减产10％以上，病害严重的地块几乎绝收。本项研究采用基因工程方法，获得了对芜青花叶病毒病具有高抗性的转基因白菜株系，为白菜育种工作提供了新抗源材料。新的抗病毒基因NIa具有自主知识产权，除白菜外，预计还可以广泛用于油菜、甘蓝等其它十字花科重要农作物的抗病毒基因工程研究。研究建立的原位真空渗入转化技术，还为高体培养再生能力差的农作物或优良品种的遗传转化，开辟了一条新的转基因技术途径。

（编号：2001-1-2-9）

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